蛋白質(zhì)的免疫染色法檢測分析

    轉(zhuǎn)印到紙上的蛋白質(zhì)抗原，可與其專一性抗體結合，再以二次抗體-酶結合體（2nd Ab-HRP） 或Protein A-HRP 呈色；可在一群轉(zhuǎn)印色帶中，專一性地挑出目標蛋白質(zhì)，是zui有用的檢定工具 （Burnett,1981）。

    藥品試劑：

    抗體溶液：可用傳統(tǒng)抗血清或單株抗體，其zui適使用濃度，隨抗體效價不同而異，以下為一般適用范圍的參考，均以明膠-NET 稀釋的。

    a. 傳統(tǒng)抗血清： 1:100 到1:1,000

    b. IgG （冷凍干燥品）： 10~50 μg/mL

    c. 單株抗體 （小白鼠腹水） ： 1:200到1:5,000

    d. 單株抗體 （細胞培養(yǎng)液）： 原液或1:10明膠-NET：用來稀釋抗體溶液或酶聯(lián)體明膠gelatin （Merck 4070, 0.25%） 5.0 gm；NaCl （0.15 M） 17.5 gm；EDTA （5 mM） 3.6 gm；Tween-20 （0.05%） 1.0 mL；Tris （Tris base, 50 mM） 12.1 gm加熱溶解于1,800 mL 純水后pH 調(diào)到8.0，再加水到 2,000 mL

    酶聯(lián)體：可使用2nd Ab-HRP 或Protein A-HRP，使用濃度每家商品不同，約為1:1,000到1:5,000 的間，以明膠-NET 稀釋的。

    PBST 洗液DAB 基質(zhì)溶液：DAB （diaminobenzidine, Sigma D-5637） 5 mg溶于100 mL Buffer A-0，再加10 μL H2O2，新鮮配制，避光貯存。 DAB 為致癌物質(zhì)，稱量時勿吸入DAB 細塵，并小心處理秤量紙。

    方法步驟：

    1） 尿素洗過夜的轉(zhuǎn)印紙再以10 mL PBST 洗三次，每次約10 min，均在上述方形培養(yǎng)皿中進行。

    2） 轉(zhuǎn)印紙放在明膠NET 溶液中反應，置室溫中反應1 h。一般使用方形培養(yǎng)皿當容器，但亦可裝入塑料袋中反應，較節(jié)省試劑用量。

    3） 反應后，以PBST 浸洗二次。

    4） 把轉(zhuǎn)印紙放在抗體溶液中反應，置室溫反應1 h。

    5） 反應后以PBST 洗三次，改用酶聯(lián)體反應，在室溫下反應1 h。

    6） 以PBST 洗四至五次，注意容器也要洗干凈。

    7） 加入DAB 基質(zhì)溶液約10 mL 呈色，盡量避光，并且不時搖動呈色液。

    8） 數(shù)分鐘內(nèi)可呈色，在背景加深前倒去DAB，以水沖過數(shù)次后晾干。

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